Hội chứng phân trắng (WFS) là một bệnh mới nổi ở tôm penaeid (Penaeus mono-don và P. vannamei) đư ợc xác định bởi sự hiện diện của các dải phân trắng nổi trên mặt nước ao nuôi thương phẩm. Mặc dù các biểu hiện lâm sàng của WFS đã đư ợc xác định rõ ràng

như nguyên nhân cơ bản vẫn chưa rõ ràng. WFS có liên quan đến một số mầm bệnh đường ruột, bao gồm Enterocytozoon hepatopenaei (EHP). Hiệp hội này dựa trên các nghiên cứu cho thấy các khu vực đã được báo cáo về WFS, tỷ lệ lưu hành và mức độ nghiêm trọng của nhiễm trùng EHP rất cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi mô tả một quá trình sinh sản

Thử nghiệm của WFS ở P. vanna-mei đã bị nhiễm EHP trước và được thử thách với một chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân lập từ đường tiêu hóa của tôm có biểu hiện WFS. Sau thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, tôm có phân trắng và đường tiêu hóa đổi màu trắng được phân tích bằng mô bệnh học, lai tại chỗ và PCR định lượng. Phân tích mô học đã xác nhận các tổn thương của EHP và hoại tử gan tụy nhiễm trùng ở gan-tụy của tôm tiếp xúc với cả hai mầm bệnh. PCR định lượng cho thấy tôm nhiễm cả EHP và V.

parahaemolyticus có lư ợng EHP cao hơn đáng kể so với tôm chỉ nhiễm EHP. Đây là minh chứng đầu tiên về sự sinh sản thử nghiệm của WFS trong điều kiện phòng thí nghiệm khi động

Vật bị nhiễm đồng thời EHP và V. parahaemolyticus. Dữ liệu cho thấy mối quan hệ cộng hư ởng giữa EHP và V. parahaemolyticus phân lập dẫn đến biểu hiện bệnh WFS. Chúng tôi đề xuất rằng các dấu hiệu chung của WFS có thể được sử dụng như một dấu hiệu cho thấy sự hiện diện của nhiễm EHP liên quan đến một chủng vi khuẩn Vibrio spp đường ruột cụ thể.

Giới thiệu

Hệ vi sinh vật đường ruột tôm là nền tảng cho dinh dưỡng, sự tăng trưởng, khả năng kháng mầm bệnh và duy trì cân bằng nội môi của vật chủ [1, 2]. Đặc điểm kiếm ăn của tôm như:

Bằng vi sinh vật thay thế, làm mất ổn định hệ vi sinh vật đư ờng ruột dẫn đến nhiễm trùng và đồng nhiễm trùng trong đư ờng tiêu hóa (GI) đa dạng về mặt phân loại [1, 2]. Mặc dù có rất ít thông tin về cơ chế miễn dịch cụ thể do hệ vi sinh vật đường ruột tôm cung cấp nhưng có bằng chứng về sự tương tác của nó với các hoạt động tiêu hóa ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của tôm và mức độ nghiêm trọng của bệnh. Tương tự như vậy, các bệnh mới nổi được phát hiện nhắm vào gan tụy tôm gây ức chế tăng trưởng, chênh lệch kích thước, chán ăn và tử vong mãn tính [3]. Các bệnh tôm đư ợc xác định gần đây có biểu hiện lâm sàng này là bệnh microsporidiosis gan-tụy (HPM) do Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây ra và Hội chứng phân trắng (WFS) mà tác nhân gây bệnh hoặc các tác nhân vẫn chưa được xác định.

HPM là một bệnh về gan tụy ở tôm Thẻ do một số loài microsporidians bao gồm EHP gây ra. Loài microsporidian này đã được tìm thấy ở một số nư ớc châu Á như Trung Quốc, Việt Nam, Malaysia, Indonesia, Thái Lan và Ấn Độ [4–6]. Gần đây, EHP đã được báo cáo ở Tây bán cầu ở Nam Mỹ [7, 8]. Dấu hiệu lâm sàng chính của EHP ở cấp độ trang trại là chậm tăng trưởng [9], dẫn đến sự thay đổi kích thước và tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR) tăng lên. Trong giai đoạn nặng của bệnh, tôm nhiễm EHP thường có vỏ mềm và chết mãn tính [10]. EHP đã đư ợc báo cáo ở một số loài tôm thẻ nuôi bao gồm tôm sú P. monodon [4], P. vannamei [11] và P. stylirostris [12, 13]. EHP là một loại ký sinh trùng nội bào sinh sôi nảy nở trong tế bào chất của các tế bào biểu mô ống thận bị ảnh hưởng trong gan tụy bao gồm tế bào F, tế bào B và tế bào R [13]. Mô học của các mô bị nhiễm bệnh cho thấy sự hiện diện của các thể vùi ư a kiềm trong tế bào chất với hình dạng tròn hoặc không đều trong các tế bào biểu mô gan tụy tương ứng với giai đoạn plasmodium. Các tổn thương mô học khác bao gồm sự bong tróc từ nhẹ đến nặng của các tế bào biểu mô ống gan, các giọt lipid thấp và sự hiện diện của các bào tử đư ợc giải phóng vào lòng ống gan tụy [9, 10]. Ở cấp độ trang trại, WFS biểu hiện dư ới dạng các sợi phân trắng nổi dọc theo mặt nước trong ao nuôi thương phẩm. Tôm trong các ao này có các dấu hiệu lâm sàng bất thường như tốc độ tăng trưởng kém, chênh lệch kích thước, đường tiêu hóa có màu từ vàng đến trắng, mềm vỏ và chết mãn tính [6, 8, 14]. Mặc dù mối liên quan giữa EHP và WFS đã được đề xuất từ lâu như  :Chưa có nghiên cứu nào tái tạo thành công hội chứng này trong môi trường phòng thí nghiệm đư ợc kiểm soát. Ngay cả khi nhiễm EHP nghiêm trọng xảy ra, WFS không phải lúc nào cũng biểu hiện [15], những quan sát này cho thấy WFS là kết quả của sự tương tác của nhiều vi sinh vật và (các) tác nhân gây bệnh khác vẫn chưa được xác định. Mối liên quan chặt chẽ giữa WFS và EHP đã được báo cáo ở các vùng lưu hành EHP ở Đông Nam Á [6] và Venezuela [8]. Trong những trường hợp này, WFS và EHP được phát hiện cùng với một mầm bệnh cơ hội khác, Vibrio spp., gây hoại tử gan tụy nhiễm trùng (SHPN) [5, 6, 10].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập và xác định chủng Vibrio parahaemolyticus là mối liên kết còn thiếu giữa EHP và WFS. Việc đồng nhiễm tôm nhiễm EHP bằng thử thách ngâm với một chủng V. parahaemolyticus độc nhất được phân lập từ ruột tôm (P. vanna-mei) biểu hiện WFS cho phép chúng tôi cung cấp bằng chứng thực nghiệm đầu tiên về khả năng sinh sản WFS. Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là minh chứng đầu tiên về khả năng sinh sản của WFS trong điều kiện phòng thí nghiệm được kiểm soát bằng cách sử dụng hai mầm bệnh độc nhất.

Nguyên liệu và phương pháp

Tôm thẻ vannamei không chứa mầm bệnh (SPF) được lấy từ Viện Đại dương (Oahu, Hawaii). Trong ít nhất hai năm liên tiếp, quần thể này đã có kết quả xét nghiệm PCR âm tính với tất cả các mầm bệnh được OIE liệt kê cũng như các mầm bệnh không được OIE liệt kê, bao gồm cả EHP. Thử nghiệm sinh học được thực hiện tại Phòng thí nghiệm bệnh học nuôi trồng thủy sản của Đại học Arizona. Tất cả quy trình lấy mẫu và an tử cho tôm được thực hiện theo hướng dẫn do Hiệp hội Y khoa Thú y Hoa Kỳ (AVMA) thiết lập [16].

Phân lập Vibrio parahaemolyticus từ tôm P. vannamei trư ng bày WFS và chuẩn bị cấy

Đường tiêu hóa (GI) của tôm thẻ P. vannamei non biểu hiện WFS khi nuôi lớn ao đã được mổ xẻ và một phần nhỏ của đường tiêu hóa đư ợc đặt trực tiếp trên đĩa Sucrose (TCBS) (DifcoTM) muối mật tỷ lệ ThiosulfateCit và được ủ ở tốc độ tăng trưởng 30 đêm, chỉ 0C trong 24 giờ. Sau hơn một-có Đơn vị hình thành khuẩn lạc âm tính sucrose (CFU) có mặt trong cái đĩa. MỘT CFU được chọn và mạ lên đĩa Tryptic Soy Agar (Sigma Aldrich) chứa 2,5% NaCl (TSA+) để tiếp tục duy trì nền văn hóa. Việc định danh vi khuẩn đư ợc thực hiện bằng Khuếch đại PCR và giải trình tự vùng 16S rRNA [17]. Ngoài ra, PCR phát hiện gen ToxR và gen PirABvp đư ợc thực hiện theo các giao thức đã được công bố trước đó [18, 19]. Để chuẩn bị vật liệu cấy cho thí nghiệm lây nhiễm, Tryptic Soy Broth (TSB) (DifcoTM) đư ợc bổ sung 2% NaCl (TSB+) đư ợc sử dụng để nuôi cấy chủng phân lập ở 30˚C qua đêm với lắc nhẹ (100 vòng/phút) để đạt 1,5 × 109 CFU/mL.

Phân lập EHP đư ợc sử dụng trong nghiên cứu này đư ợc lấy từ quần thể P. van-namei nhiễm EHP (Thái Lan phân lập). Để sản xuất tôm nhiễm EHP, thử thách sống chung đã đư ợc thực hiện bằng cách nuôi 50 con tôm thẻ chân trắng SPF (trọng lượng trung bình 2,5–3,5) với 50 con tôm được xác nhận dương tính với EHP trong bể 1000 L trong 60 ngày. Gan tụy tôm thử thách thí nghiệm đã được mổ xẻ và bảo quản trong môi trường cố định Davidsonvà 95% etanol. Nhiễm EHP ở tôm SPF đư ợc xác nhận bằng PCR và mô bệnh học khi kết thúc thử thách chung sống.

Thử thách thử nghiệm để tái tạo WFS

Để tái tạo WFS trong môi trư ờng phòng thí nghiệm đư ợc kiểm soát, việc ngâm vi khuẩn thử nghiệm thử thách được thực hiện bằng cách sử dụng V. parahaemolyticus (phân lập WFS) làm vật liệu cấy và cả quần thể P. vannamei bị nhiễm SPF và EHP. Hai thử nghiệm độc lập đã đư ợc tiến hành (Thử nghiệm 1 và Thử nghiệm 2). Trong mỗi thử nghiệm, bốn bể 90-L được đổ đầy nước biển nhân tạo được điều chỉnh ở mức 30 ppt (Crystal Sea Marinex, Baltimore, Maryland), nhiệt độ đư ợc giữ ở mức 26˚C (±0,6) và độ pH dao động trong khoảng 7,5–8,0. Đối với thử nghiệm 1, 7 trư ờng hợp SPF và 8 trư ờng hợp P. bị nhiễm EHP. vannamei (trọng lượng trung bình 6,0 ±1,1 g) đã đư ợc sử dụng trong khi ở thử nghiệm 2, 10 tôm SPF và 8 tôm P. vannamei nhiễm EHP (trọng lư ợng trung bình: 7,1±2,0 g) đư ợc sử dụng để gây nhiễm thực nghiệm. Các Việc bố trí các bể cho thử nghiệm 1 và 2 được tóm tắt trong Bảng 1.Đối với cả hai thử nghiệm, thử thách V. parahaemolyticus đư ợc thực hiện thông qua thử thách ngâm nước. bằng cách thêm môi trư ờng nuôi cấy qua đêm vào bể để thu được nồng độ vi khuẩn cuối cùng là:

Bảng 1. Thiết kế thí nghiệm và tỷ lệ sống so sánh của tôm đã bị nhiễm EHP trư ớc và bị cảm nhiễm với V. parahaemolyticus (phân lập WFS) trong hai thử nghiệm độc lập.

Sự thử nghiệm

Xe tăng

Nhóm Số lượng động vật (ban đầu) Số lượng động vật (cuối cùng) Tỷ lệ sống sót cuối cùng CV% WFS

1	1	SPF Kiểm soát tiêu cực	7	6	85,7%	21.4	KHÔNG
	2	SPF +V. parahaemolyticus EHP	7	6	85,7%	27,6	KHÔNG
	3	kiểm soát dư ơng tính	số 8	số 8	100,0%	41,6	KHÔNG
	4	EHP + V. parahaemolyticus SPF	7	4	57,1%	40,0	Đúng
2	1	Kiểm soát âm tính SPF +	10	9	90,0%	12.0	KHÔNG
	2	V. parahaemolyticus EHP kiểm	10	số 8	80,0%	10.1	KHÔNG
	3	soát dư ơng tính EHP +	9	4	44,4%	30,8	KHÔNG
	4	V. parahaemolyticus	số 8	2	25,0%	40,7	Đúng

1,0 × 106 CFU/mL. ViệC Cấy vi khuẩn được tiến hành bốn lần trong suốt thử thách vào ngày 0, 1, 4 và 18 ngày sau khi nhiễm bệnh (dpi). Nhóm đối Chứng dương tính với EHP không

được tiêm V. parahaemolytiCus, trong khi nhóm SPF không bị nhiễm EHP Cũng như V. parahaemolytiCus. Tỷ lệ tử vong, sự hiện diện của các sợi phân trắng và màu trắng trong đường tiêu hóa (GI-TraCt) đượC ghi nhận hàng ngày trong suốt thí nghiệm. Tôm hấp hối Cũng như tôm sống sót vào Cuối thí nghiệm đã được cố định trong Chất cố định AFA Của Davidson [20]. Khi kết thúc thử thách thử nghiệm, những động vật sống sót được Chia đôi theo Chiều dọc thành hai nửa với một nửa được cố định trong chất cố định Davidson (AFA) [20] và nửa còn lại được bảo quản trong ethanol 95% để phát hiện EHP bằng PCR. Thời gian thử nghiệm lần lượt là 23 và 30 ngày đối với thử nghiệm 1 và 2.

Mô bệnh học và lai tại chỗ các mẫu cố định bằng rượu-formalin-axetiC (AFA) Của Davidson đã được xử lý, nhúng vào parafin và cắt thành từng phần (dày 5 μm) theo các phương pháp tiêu chuẩn [ 20, 21]. Sau khi nhuộm bằng hema-toxylin và eosin (H&E), các phần được phân tích bằng kính hiển vi ánh sáng. Mức độ nghiêm trọng Của nhiễm trùng/tổn thương EHP được phân loại từ G0-G4 theo Lightner [21] với G0 không có bệnh và G4 là sự hiện diện của các tổn thương nghiêm trọng và sự phá hủy mô tiến triển.

EHP 510 F (5′-GCC TGA GAG ATG GCT CCC ACG T-3′) và EHP 510 R (5′-CáC mồi GCG TAC TAT CCC CAG AGC CCG A-3′) [12] được sử dụng để lai tại Chỗ (ISH). Các mồi này được nối đuôi ở đầu 30 bằng digoxigenin-11-dUTP (Công nghệ DNA tích hợp1, San Diego, CA). Tôm cố định Của Davidson đã được Chế biến và các phần mô được tạo ra (dày 5 μm) (Lightner 1996a). Sau khi khử parafin, hydrat hóa, tiêu hóa proteinase K và tiền lai, các phần được phủ bằng dung dịch lai 100 μL Chứa mồi Có nhãn DIG (100 fmol). CáC phiến kính được đặt trên bề mặt được gia nhiệt ở 90˚C trong 10 phút và được lai qua đêm ở 50˚C. Phát hiện cuối cùng được thựC hiện với kháng thể kháng digoxigenin kết hợp với phosphatase kiềm (RoChe) được hiển thị bằng cách sử dụng tetrazolium xanh nitro và 5-bromo-4-Chloro-3- indolyl phosphate [12].PCR và PCR định lượng để phát hiện V. parahaemolytiCus và định lư ợng EHP ViệC phát hiện V. parahaemolytiCus được thực hiện bằng PCR điểm Cuối sử dụng toxR làm gen mục tiêu, như đã được Công bố trướ đây [19]. Một đoạn 368 bp được khuếch đại bằng cách sử dụng các đoạn mồi F: 50-GTC-TTC-TGA-CGC-AAT-CGT-TG-30 và R: 50 -ATA-CGA-GTG-GTT-GCT-GT-C-ATG -30 . Các hạt PCR sẵn sàng sử dụng PuReTaq (GE HealthCare) đã được sử dụng để khuếch đại bằng cách sử dụng các thông số chu trình sau: biến tính ban đầu ở 94˚C trong 3 phút, tiếp theo là 35 Chu kỳ 94˚C trong 30 giây, 63˚C trong 30 giây và 72˚C trong 30 giây và gia hạn cuối cùng ở 72˚C trong 5 phút.

Sau khi khuếch đại, các sản phẩm PCR được điện di trong gel agarose 1,5% Có Chứa 1X GelRed và hiển thị dưới ánh sáng cực tím và chụp ảnh kỹ thuật số bằng hệ thống tài liệu Gel từ Bio-Rad 1. Việc phát hiện và định lượng EHP được thực hiện bằng phương pháp PCR định lượng (qPCR) dựa trên EHP SSU rDNA theo phương pháp đã được công bố [22].Primer F:157 (50 -AGT AAA CTA TGC CGA CAA-30 ) và mồi R:157 (50 -T TAA GCA GCA CAA TCC-30 ) và đầu dò TaqMan (5-FAM-TCC TGG TAG TGT CCT TCC GT -TAMRA-30 ) đã được sử dụng. Nồng độ DNA được Chuẩn hóa ở mức 20 ng ul-1. Các phản ứng khuếch đại được tiến hành như sau: 0,5 μM mỗi mồi, 0,1 μM đầu dò TaqMan, 1× TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix (Life TeChnologies), 50 ng DNA và nước HPLC trong thể tích phản ứng là 10 ul. Cấu hình qPCR bao gồm 20 giây ở 95˚C, sau đó là 40 Chu kỳ 1 giây ở 95˚C và 20 giây ở 60˚C. ViệC phát hiện khuếch đại và phân tích dữ liệu Cho các xét nghiệm qPCR được thực hiện bằng hệ thống PCR thời gian thực StepOnePlus (Life TeChnologies).

 

 

DL GROUP – Kiểm soát để thành công 

Địa chỉ: B2 – 108 Hacom Galacity, Thanh Sơn, Phan Rang – Tháp Chàm, Ninh Thuận

Hotline: 0818 11 39 68

Website: https://tomvisinh.vn/